습관적인 커피 섭취는 장내 미생물군을 형성하고 생리와 인지를 바꿈

• 습관적 커피 섭취는 장내 미생물군, 대사체, 면역 반응, 기분과 인지 지표를 함께 바꾸며, 커피 중단과 재도입 과정에서도 이런 변화가 시간에 따라 이어짐
• 건강한 성인 62명을 비교한 뒤 중등도 커피 섭취자에게 2주 중단과 3주 재도입을 적용한 결과, 커피를 끊으면 혈압이 낮아지고 충동성·정서 반응성이 줄었으며 PASAT 수행은 좋아짐
• 재도입 뒤에는 caffeinated 커피에서 불안과 심리적 고통 감소, PASAT 향상, 기상 시 코르티솔 저하가 나타났고, decaffeinated 커피에서는 ModRey와 PAL 같은 기억 과제 개선이 관찰됨
• 장내에서는 Veillonella, Eggerthella, Cryptobacterium curtum 같은 균주와 caffeine, theophylline, hippuric acid, ICA 같은 대사체가 커피 섭취 여부에 따라 달라졌고, 소변에서는 카페인 대사체와 phenolic 대사체가 서로 다른 양상으로 구분됨
• 미생물 종, theophylline을 포함한 대사체, 인지·행동 점수 사이에 강한 연관이 함께 나타나며, 커피가 microbiota-gut-brain axis를 조절하는 요인일 가능성을 뒷받침함

서론과 연구 목적

• 커피는 가공된 커피콩으로 만드는 식물성 음료이며, 원두 종류, 숙도, 가공, 로스팅, 추출 방식에 따라 맛과 조성이 달라짐
  • 주요 식물화학물질로 caffeine 같은 alkaloids, phenolic acids를 포함한 (poly)phenols, diterpenes, 로스팅 중 생성되는 melanoidins가 들어있음
• 중등도 커피 섭취는 여러 건강 지표와 연관됨
  • 제2형 당뇨병, 간질환, 심혈관질환, 암의 위험 감소와 연결됨 1 2 3
  • 임상적 심혈관질환이 없는 468,629명의 대규모 단면 연구에서는 가벼운~중등도 커피 섭취가 전체 사망률, 심혈관 사망률, 뇌졸중 발생률의 더 낮은 수준과 연결됨 4
  • Parkinson’s disease 위험은 여러 인간 코호트에서 용량 의존적으로 더 낮게 나타남 5 6 7
  • 메타분석에서는 우울증 위험이 더 낮게 나타났고 8 9, 인지저하를 다룬 코호트 메타분석 하나에서는 Alzheimer’s disease 발생이 27% 감소한 것으로 나타남 10
• 커피의 전신 효과와 함께 뇌 기능 변화도 함께 관찰됨
  • fMRI 연구에서는 습관적 커피 섭취자가 감각, 운동, 정서 처리와 연결된 영역에서 다른 기능적 연결성을 보임 11
  • 최근 데이터에서는 고령자에서 특히 기억과 처리 속도를 포함한 인지 수행과의 양의 상관이 나타남 12
  • 커피 섭취는 cortisol을 일시적으로 올린 뒤 습관적 사용에서는 정상화되며, 생리적 적응이 드러남 13
  • 스트레스에 대한 영향은 연구마다 결과가 엇갈림 14 15 16
• 커피는 위장관계에도 직접 작용함
  • 위산도를 높이고 소화를 돕는 호르몬 분비를 자극함
  • caffeinated와 decaffeinated 커피 모두 회장과 결장의 평활근 수축성을 높여 변비 예방에 도움을 줌 17 18
  • 커피는 커피 성분 또는 순환 대사체가 특정 생물학적 표적과 상호작용하는 직접 경로와, 장내 미생물군 같은 시스템 변화를 거치는 간접 경로를 함께 가짐
• 장내 미생물군은 커피에 반응하며, 커피는 prebiotic 유사 효과를 보임 19
  • 이런 효과는 주로 섬유질 유사 화합물과 chlorogenic acids 같은 phenolics에 의해 나타나며, 여기에는 caffeoylquinic, feruloylquinic, coumaroylquinic acids가 포함됨
  • 커피의 melanoidins는 SCFA 생성 박테리아의 성장을 촉진해 혈청 short-chain fatty acid 수치를 높일 수 있음 20 21 22
  • 일부 연구에서는 커피 섭취가 Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus 속 종 성장과 연결됨 20 23 24 25 26 27 28
  • 커피 (poly)phenols의 생체이용률과 대사는 개인별 차이가 크며, 이 차이는 gut microbiome의 영향을 받음 29 30
  • 커피 phenolics는 뇌에서 항산화 반응 인자를 활성화해 neuroinflammation을 줄일 수 있음 31 32 33 34
• 최근 metagenomics 연구는 커피와 장내 미생물군의 강한 연관을 보여줌
  • 1,000명 이상이 참여한 연구에서 150개가 넘는 식이 성분과 장내 미생물군 조성의 관계를 조사했으며, 커피 섭취가 가장 강한 상관을 보인 식품으로 확인됐고 두 번째 코호트에서도 검증됨 35
  • 커피 섭취는 butyrate 생성에 유익한 Lawsonibacter asaccharolyticus 수준 증가와 연결됨 36
  • 음식과 음료가 microbiota-gut-brain axis의 양방향 신호 경로에 미치는 중요성이 커지고 있음 37
• 커피 섭취, 중단, 재도입의 시간적 동역학과 gut microbiome이 만드는 개인별 커피 phenolics 대사 차이, 커피 섭취와 뇌 기능 사이에서 microbiome이 매개하는 기여는 아직 충분히 정리되지 않았음
• 이번 연구는 microbiota-gut-brain axis 맥락에서 커피의 작용을 동시 다층 분석으로 추적함
  • 건강한 성인 중등도 커피 섭취자와 비섭취자를 비교하고, 커피 중단과 재도입이 인지, 기분, 행동에 미치는 시간적 효과를 자기보고식 설문으로 평가함
  • 동시에 shotgun metagenomics와 targeted·untargeted metabolomics로 gut microbiota를 프로파일링함
  • stress, inflammation, microbial-derived metabolites 같은 microbiota-gut-brain axis 경로도 함께 탐색함 38
  • (poly)phenols 39, butyrate 생성 박테리아 증가 36, SCFAs와 γ-aminobutyric acid 같은 신경활성 화합물 변화도 함께 살핌 17
  • caffeine의 역할도 고려했지만, 커피는 장에 영향을 줄 수 있는 여러 화합물을 포함한 복합 혼합물로 다뤄짐

연구 설계와 참가자 특성

• 이 전향적 연구는 세 단계로 구성되며, 각 단계에서 cognition, stress, physical health, mood, immune function, gut microbiome, dietary intake, metabolite composition을 평가함
  • 설계 개요는 Fig. 1에 제시됨
• 2021년 9월부터 2023년 1월까지 아일랜드 거주 30~50세 건강한 성인 62명을 모집함
  • NCD n = 31은 커피를 전혀 마시지 않는 집단이고, CD n = 31은 보통 하루 3~5잔 커피를 마시는 중등도 섭취자임
  • baseline에서는 NCD와 CD를 횡단면으로 비교했고, 이후 절차는 CD만 진행함
• CD는 14일간 모든 종류의 커피를 중단한 뒤, washout 이후 decaffeinated n = 15 또는 caffeinated n = 16으로 배정돼 21일간 재도입을 진행함 Fig. 1A
  • 배정은 성별 층화와 5명 블록 무작위배정으로 이뤄졌고, 설계는 double-blinded, parallel design임
• 전체적으로 여성 참가자가 더 많았고, 대부분은 per vaginum으로 출생함 Table 1
• 기준 시점에서 CD는 NCD보다 하루 caffeine 섭취량이 더 많았고, NCD는 baseline 방문 전에 더 많은 caffeine을 끊었지만 금단을 유발하는 수준보다는 훨씬 낮았음 Table 1 Supplementary Data 1
• alcohol consumption, education years, CTQ sub-scores, NART 기반 predicted IQ는 두 집단 간 차이가 없었고, 개입 단계의 caffeinated와 decaffeinated 그룹 사이에서도 같은 항목 차이가 없었음 Table 1 Supplementary Data 15
• 모든 참가자는 caffeine 민감성과 관련된 ADORA2A SNP rs2298383, rs5751876 유전형 분석을 받음
  • NCD는 rs2298383에서 C/C haplotype 비율이 더 높았고 CD는 C/T가 더 많았음
  • rs5751876에서는 NCD가 T/T가 더 많았고 CD는 C/T가 더 많았음 Table 1 Supplementary Fig. 1
  • 기존 연구에서는 rs5751876의 T/T haplotype이 더 높은 커피 섭취와 연관됐지만 40, 이 표본에서는 다른 양상이 나타남
• Full size image: Fig. 1은 커피 섭취, 중단, 재도입이 cognition, physiology, craving에 미치는 변화를 시각화함
  • 패널 A는 baseline V2, 2주 금커피 뒤 V3, caffeinated 또는 decaffeinated 재도입 뒤 3주의 실험 개요를 보여줌
  • 패널 B는 baseline CD 대비 설문 결과 heatmap이며, 빨간색은 양의 effect size, 파란색은 음의 effect size를 뜻함
  • 패널 C는 caffeine abstinence 및 재도입 뒤 craving과 fatigue 관련 설문 응답 heatmap임
  • 숫자가 적힌 텍스트 박스는 Cohen’s d > 0.5인 비교를 뜻함
  • 표본 수는 baseline CD와 NCD 각각 n = 31, washout n = 31, decaffeinated n = 15, caffeinated n = 16임
• Full size table: Table 1은 baseline의 인구통계학적 특성을 제시함

식이 섭취와 일반 웰빙

• 각 방문 전 7일간 가중 식이일지로 음식 섭취를 모니터링함
• baseline에서 CD와 NCD 사이에 식이 섭취 차이는 관찰되지 않았음 Supplementary Data 2a
• 2주간 caffeine abstinence 뒤에도 CD의 식이 섭취는 대체로 변하지 않았음
  • caffeinated 그룹은 magnesium 섭취가 약간 낮게 보고됐고 이 변화는 연구 종료까지 유지됨
  • decaffeinated 그룹은 baseline 대비 종료 시점에 selenium 섭취가 약간 증가함 Supplementary Data 2b–e
  • 그 외 macro-, micronutrients, food groups 섭취 차이는 관찰되지 않았음
• baseline에서 CD와 NCD는 BMI, 혈압, stress, anxiety, depression, gastrointestinal symptoms, sleep quality, physical activity에서 차이가 없었음 Supplementary Data 3
• caffeine washout 뒤에도 이 지표들은 변하지 않았음 Supplementary Data 4
• 다만 CD는 2주 커피 중단 뒤 수축기와 이완기 혈압이 유의하게 감소함 Supplementary Data 5
• BMI는 washout과 커피 개입 뒤 caffeinated, decaffeinated 두 그룹 모두에서 변하지 않았음
• caffeinated 커피를 섭취한 쪽은 decaffeinated 그룹과 비교해 수축기 혈압 감소가 나타남 Supplementary Data 6

행동과 인지 변화

• 커피 중단과 재도입 전반

  • 자기보고식 설문에서 CD는 NCD보다 UPPS-P 충동성 척도 총점과 Sensation Seeking 하위점수가 더 높았음 Fig. 1B Supplementary Data 3
  • CD는 NCD보다 ERS 점수도 더 높았음 Fig. 1B Supplementary Data 3
  • UPPS-P 총점과 Negative Urgency는 커피 중단 뒤 baseline보다 유의하게 낮아졌고, ERS의 sensitivity, intensity, persistency, 총점도 함께 낮아짐 Fig. 1B Supplementary Data 4
  • PASAT 수행은 커피 중단 뒤 향상됐고, 재도입 단계에서는 caffeinated 그룹에서 점수가 증가함 Supplementary Data 4 Supplementary Data 5
  • 개입 시작과 종료를 비교했을 때 caffeinated 그룹은 STAI-Trait anxiety와 HSCL psychological distress가 감소했고, 두 그룹 모두 perceived stress, BDI, UPPS-P가 개선됨 Supplementary Data 5
  • 연구 시작 시점과 개입 후 시점을 비교하면 두 그룹 모두 UPPS-P, ERS 총점, ERS sensitivity가 감소했고, ERS intensity는 decaffeinated drinkers에서만 감소함 Supplementary Data 6
  • caffeinated drinkers에서는 perseverance와 negative urgency가 감소했고, decaffeinated drinkers에서는 positive urgency가 감소함 Supplementary Data 6
  • STAI-Trait는 caffeinated drinkers에서 감소했고, HSCL, PSQI, IPAQ는 decaffeinated drinkers에서 개선됨 Supplementary Data 6

• 기억력과 학습

  • 선언적 기억 평가는 ModRey episodic memory test로 수행됨
  • baseline에서 CD와 NCD의 수행은 비슷했고, 두 집단 모두 baseline에서 delayed recall이 향상됨 Supplementary Data 7
  • 연구 시작, baseline, 종료 시점을 비교하면 decaffeinated 커피를 받은 참가자에서만 유의한 개선이 나타남 Supplementary Data 8
  • decaffeinated 그룹은 ModRey의 여러 구성 요소에서 개선을 보였고, caffeinated 그룹에서는 그런 변화가 없었음
  • PAL task에서도 baseline의 CD와 NCD 간 유의한 차이는 없었고, 개입 후에는 decaffeinated 그룹만 PAL errors 감소를 보였음 Supplementary Data 7 Supplementary Data 8
  • ERT에서는 baseline의 CD와 NCD 간 차이가 없었고, 개입 후에도 caffeinated와 decaffeinated 모두 baseline 대비 유의한 차이가 없었음 Supplementary Data 8

• 금단, 갈망, 피로

  • CD의 2주 커피 중단 동안 day 2, day 4, day 14에 자기보고식 설문으로 caffeine withdrawal 효과를 평가함 Fig. 1A
  • craving 점수는 이 기간 동안 안정적으로 유지됨 Fig. 1C Supplementary Fig. S8
  • withdrawal symptoms는 중단 시작 시점에 높았고 day 4와 visit 3에서 유의하게 감소했으며, 졸림과 두통을 포함한 모든 지표가 줄어듦 Supplementary Fig. S9
  • VAS 자기보고에서는 중단 기간 동안 fatigue 감소, energy 증가가 나타남 Supplementary Fig. S9
  • 개입 단계 전반의 4개 시점에서는 전체적인 withdrawal symptoms 변화가 크지 않았고, decaffeinated drinkers에서 drowsiness와 fatigue 증가가 나타남 Supplementary Fig. S10a
  • decaffeinated 참가자에서는 연구 시작 시점에 “decreased sociability, motivation to work”가 증가했고, caffeinated 참가자에서는 T4에서 시간에 따른 유의한 증가와 함께 같은 항목의 유의한 감소도 함께 관찰됨 Supplementary Fig. S10d

스트레스와 코르티솔

• SECPT로 스트레스와 코르티솔 생리를 평가했을 때, NCD는 CD보다 자기보고 불안 증가량인 ΔSTAI-State가 더 큰 비유의 경향을 보였고 시험 전 불안도 더 높았음 Supplementary Data 9
• 연구 시작 시점의 SECPT에서는 CD와 NCD 사이에 타액 코르티솔 차이가 없었고, 중재 기간의 SECPT에서도 caffeinated·decaffeinated 여부와 관계없이 타액 코르티솔은 기준선과 다르지 않았음 Supplementary Fig. S3a, b Supplementary Fig. S7
• CAR에서도 baseline의 CD와 NCD 차이는 없었고, 커피 중단 후에도 CAR 변화는 없어 CD의 caffeine 금단이 코르티솔 수준을 바꾸지 않았음 Supplementary Fig. S3a, b Supplementary Fig. S4
• 중재 후 caffeinated 그룹은 기상 시 타액 코르티솔이 더 낮아졌고, decaffeinated 그룹의 CAR은 변하지 않았음 Supplementary Fig. 5a, c
• SECPT 동안 두 그룹 모두 스트레스, 기분, 불안을 묻는 자기보고 설문 변화는 작게 유지됨
  • caffeinated 그룹은 PASA self-concept와 secondary appraisal이 증가함
  • decaffeinated 그룹은 Positive Affect Schedule 점수가 더 높아짐 Supplementary Data 9
• caffeinated 커피와 decaffeinated 커피를 받은 참가자는 중재 기간 동안 지각된 스트레스, 우울, 충동성 점수가 모두 낮아졌고, 기분 개선은 카페인 유무와 무관하게 나타남 Supplementary Data 10

면역 반응과 위장 기능

• 말초 혈액 염증 지표

  • baseline에서 CD는 NCD보다 CRP가 낮고 IL-10은 높게 나타남 Supplementary Fig. 13 Supplementary Data 11
  • 커피 금지는 CRP와 TNFα 증가로 이어짐 Supplementary Fig. 13 Supplementary Data 12
  • 중재 종료 시 caffeinated 그룹은 중재 전보다 IL-10과 IL-6가 더 낮아짐 Supplementary Fig. 13 Supplementary Data 13
  • 재도입 단계 종료 시 decaffeinated 커피는 CRP와 TNFα를 높였고, caffeinated 섭취는 IL-10과 IL-6를 낮춤 Supplementary Data 11 Supplementary Data 14

• LPS 자극 ex vivo 반응

  • 전혈에 LPS를 처리한 ex vivo 자극에서는 baseline의 NCD가 CD보다 TLR4 자극 후 IL-6 증가폭이 더 큼
  • 커피 없이 2주를 보낸 뒤에는 baseline 대비 IL-6 분비가 유의하게 증가함
  • 중재 후에는 caffeinated와 decaffeinated 두 그룹 모두 LPS 자극 시 IL-6가 감소함
  • 연구 시작과 종료 시점을 비교하면 decaffeinated 커피를 마신 참가자에서 TNFα 분비가 baseline 대비 유의하게 감소함 Supplementary Fig. S14 Supplementary Data 14

• 위장 기능

  • Bristol Stool Chart 기반 자기보고 GI 기능 평가에서는 baseline CD의 대변 점수가 NCD보다 낮아 변 일관성 차이가 소폭 나타남
  • caffeine 금지 후 CD의 대변 점수는 baseline보다 증가함 Supplementary Fig. 2 Supplementary Fig. 12
  • 중재 단계 전체에서는 어느 시점에서도 대변 점수의 유의한 변화가 없었음

대변 비표적 대사체 변화

• CD와 NCD의 비표적 대변 대사체 비교에서 CD는 대변 내 caffeine 변화가 뚜렷했고, theophylline, 1,7-dimethylxanthine, hippuric acid 농도도 더 높았음 Fig. 2
  • theophylline은 커피 alkaloid이고 1,7-dimethylxanthine은 카페인 대사산물임
  • hippuric acid는 커피와 다른 (poly)phenol 식이원 또는 방향족 아미노산과 catecholamine의 내인성 대사에서 나오는 페놀 대사체로 정리됨 43
• CD에서는 indole-3-propionic acid (IPA), indole-3-carboxyaldehyde (ICA) 같은 indole류와 신경전달물질 GABA가 유의하게 감소함
• CD가 2주간 커피를 끊은 뒤에는 caffeine, theophylline, 1,7-dimethylxanthine, hippuric acid가 유의하게 감소했고, ICA는 유의하게 증가함
• caffeinated와 decaffeinated 커피를 다시 도입한 뒤 대변 대사체 농도는 서로 다른 반응을 보였고, caffeine, theophylline, hippuric acid, 1,7-dimethylxanthine은 baseline 수준으로 돌아가지 않았음
• pentose, hippuric acid, fumaric acid 농도는 카페인 존재 여부에 따라 달라짐 Fig. 2
• Full size image: Fig. 2는 baseline CD 대비 untargeted faecal metabolomics heatmap임
  • 비교 축은 NCD 대 CD, washout 대 CD baseline, CAF 또는 DECAF 대 CD baseline으로 구성됨
  • 빨간색은 양의 effect size, 파란색은 음의 effect size, 흰색은 0 effect를 뜻함
  • 숫자 텍스트 박스는 Cohen’s d > 0.5를 뜻함
  • 표본 수는 baseline CD와 NCD 각 n = 31, washout n = 31, decaffeinated n = 15, caffeinated n = 16임

소변 표적 대사체와 커피 시그니처

• 간에서의 caffeine 대사는 N-methylated xanthines, methyluric acids, acetylated uracil metabolites를 생성함 44
• 커피와 카페인 관련 화합물을 겨냥한 targeted urinary metabolomics에서 NCD는 CD보다 1- 및 3-methylxanthine, theobromine, 여러 methyluric acid 배출량이 더 낮았음 Supplementary Fig. 15
• CD는 카페인 관련 대사체 외에도 caffeoylquinic, cinnamic, phenylpropanoic, phenylacetic, benzoic acids, hydroxybenzene derivatives를 포함한 phenolic metabolites의 소변 농도가 더 높음
• 커피 금지 뒤 CD의 소변 대사체 프로필은 alkaloid와 phenolic 대사체 모두에서 연구 시작 시점의 NCD와 거의 닮아감
  • 다만 theobromine, 3-methyxanthine, 3,7-dimethyl uric acid는 금지 전 수준과 비교해 유의하게 변하지 않음
• caffeinated 또는 decaffeinated 커피를 재도입하면 대부분의 phenolic metabolites는 증가해 CD에서 기록된 농도 수준에 가까워짐
• 반면 카페인 대사체는 예상대로 caffeinated 커피를 마셨을 때만 CD 수준으로 돌아가고, decaffeinated 커피에서는 그렇지 않음
• phenolic metabolites는 개인 간 변동성이 매우 컸고, alkaloids는 훨씬 작았음 Supplementary Fig. 15

장내 미생물군 변화

• 커피 섭취는 장내 미생물 조성에 영향을 주었고, 그룹 사이에서 strain-specific 차이가 유의하게 나타남 Fig. 3
• baseline에서 NCD의 대변은 CD보다 Cryptobacterium curtum, Eggerthella sp. CAG:209, Eggerthella sp. CAG 51_9, Firmicutes CAG:94가 유의하게 낮았고, Veillonella parvula, Veillonella sp. ACP1, Haemophilus parainfluenzae는 더 높았음
• CD가 커피를 마시지 않은 기간에는 서로 다른 3개 시점에서 Cryptobacterium curtum 수준이 감소함
• 커피를 다시 도입하면 카페인 유무와 무관하게 장내 미생물 조성의 유의한 변화가 나타났고, 유의하게 변한 모든 strain의 수준이 시간에 따라 이동함
• 재도입 단계 21일차에는 caffeinated와 decaffeinated 두 그룹 모두에서 Veillonella sp. ACP1의 유의한 bloom이 나타남
• Veillonella parvula는 decaffeinated 커피 섭취자의 대변에서 유의하게 증가했지만, CD에서는 유의하게 증가하지 않았음 Fig. 3
• alpha-diversity는 NCD와 CD 사이에서는 유의하게 달랐지만, CD의 baseline과 washout 후 또는 중재 후를 비교하면 유의하게 다르지 않았음 Supplementary Data 16
• 커피 금단은 alpha-diversity와 beta-diversity 모두에 영향을 주지 않았고, 종 수준에서는 Eggerthella sp. CAG:209와 Firmicutes CAG:94가 금단 뒤 NCD와 유사한 수준으로 돌아감 Fig. 3 Supplementary Data 16
• 재도입 뒤 Day 2 시점에서는 alpha-diversity와 beta-diversity 모두 바뀌지 않았지만, NCD와 CD 사이에서 차이가 났던 7개 균주 전체는 caffeinated 또는 decaffeinated 재도입의 영향을 유의하게 받음
• Full size image: Fig. 3은 baseline CD 대비 microbial relative abundance heatmap임
  • 비교는 NCD 대 CD, washout 대 CD baseline, CAF 또는 DECAF 대 CD baseline으로 구성됨
  • 빨간색은 양의 effect size, 파란색은 음의 effect size, 흰색은 0 effect를 뜻함
  • 숫자 텍스트 박스는 Cohen’s d > 0.5를 뜻함
  • 표본 수는 baseline CD와 NCD 각 n = 31, washout n = 31, decaffeinated n = 15, caffeinated n = 16임

(poly)phenol 섭취와 표적 phenolic acid 대사체

• 참가자가 제출한 7-day food diaries를 바탕으로 일일 (poly)phenol 함량을 정량화함
• CD와 NCD를 비교하면 CD의 총 (poly)phenols가 더 높았고, 이는 주로 phenolic acids, 특히 hydroxycinnamic acids가 높았기 때문임 Supplementary Data 17a
• 2주간 커피를 끊은 뒤 CD의 총 (poly)phenols는 감소했고, 주된 감소 항목은 phenolic acids, 특히 hydroxycinnamic acids였음 Supplementary Data 17b
• 커피 금지 종료 시점과 caffeinated 또는 decaffeinated 커피 중재 종료 시점을 비교하면 두 그룹 모두 총 (poly)phenols, phenolic acids, hydroxycinnamic acids가 증가함
  • 다른 (poly)phenols는 caffeinated 커피 그룹에서만 증가함 Supplementary Data S17 c
• 3개 연구 단계 전반에서 대변의 benzoic, phenylacetic, propanoic, cinnamic acid 유도체를 정량화함
• NCD는 CD보다 3-hydroxybenzoic acid와 3ʹ,4ʹ-dihydroxycinnamic acid가 낮았고, 4-hydroxybenzoic acid와 3-(3ʹ,4ʹ-dihydroxyphenyl)propanoic acid는 더 높았음 Fig. 5
• 2주간 금지 뒤 CD의 3ʹ,4ʹ-dihydroxycinnamic acid는 유의하게 감소했고, 같은 기간 4-hydroxybenzoic acid는 증가함
• caffeinated와 decaffeinated 커피를 다시 도입한 뒤에는 두 커피 사이에서 대사체 농도의 눈에 띄는 차이가 없었고, 3ʹ,4ʹ-dihydroxycinnamic acid, 4-hydroxybenzoic acid, 3-(3ʹ,4ʹ-dihydroxyphenyl)propanoic acid는 카페인 유무와 관계없이 모든 참가자에서 baseline 대비 유의하게 증가함
• Full size image: Fig. 5는 baseline CD 대비 targeted metabolomics heatmap임
  • 비교는 NCD 대 CD, washout 대 CD baseline, CAF 또는 DECAF 대 CD baseline으로 구성됨
  • 빨간색은 양의 effect size, 파란색은 음의 effect size, 흰색은 0 effect를 뜻함
  • 숫자 텍스트 박스는 Cohen’s d > 0.5를 뜻함
  • 표본 수는 baseline CD와 NCD 각 n = 31, washout n = 31, decaffeinated n = 15, caffeinated n = 16임

통합 연관 분석

• 커피 섭취와 금지에 따라 바뀐 인지 점수, 미생물 종 풍부도, 대변 대사체 농도 사이의 상호작용을 보기 위해 pairwise mixed model 분석을 수행함 Fig. 4
• 두 Veillonella 종은 theophylline과 강하게 연관되었고, theophylline은 다시 PSS, PSQI, ModRey를 포함한 여러 인지 점수와 강하게 연관됨
• caffeine 자체는 나열된 모든 종과 연결됐고, 모든 인지 및 행동 출력과 상관됨
• 변화한 9개 대사체 중 theophylline, ICA, fumaric acid, caffeine, 1,7-dimethylxanthine은 여러 미생물 종과 인지·행동 결과에 강하게 연결됨
• Firmicutes sp. CAG:94와 Eggerthella sp. 51_9는 여러 대사체와 유의한 연결을 보였고, GABA, pentose, IPA, hippuric acid는 미생물 종 또는 인지·행동 출력과 무관하게 독립적으로 변화함
• Full size image: Fig. 4는 Fig. 1, 2, 3 데이터를 통합한 Sankey diagram임
  • 왼쪽은 microbial species, 가운데는 metabolites, 오른쪽은 cognition and behaviour를 나타냄
  • 각 연결선은 generalised linear mixed-effects model로 측정한 통계적 연관성을 뜻함
  • 좌우 노드의 R² 값은 해당 열과 중앙 대사체 노드 사이의 결정계수를 나타냄
  • 연결선 두께는 해당 모델의 marginal R²를 뜻하며, 선은 R² > 0.3이면 불투명하고 0.3 > R² > 0.1이면 반투명함
  • Benjamini-Hochberg 보정 p값 < 0.001인 연관만 표시됨
• 참가자 소변의 targeted (poly)phenol metabolites에도 같은 분석을 적용했을 때, 미생물 종과 uric acid, xanthine, glucuronide 계열 대사체가 함께 작용하며 인지 출력과 강하게 연결되는 추가 근거가 나타남 Fig. 6
• Full size image: Fig. 6은 Fig. 1, 2, 3 데이터를 통합한 Sankey diagram임
  • 각 노드는 microbial species, metabolites, behavioural or cognitive output을 나타냄
  • 각 연결선은 generalised linear mixed-effects model로 측정한 통계적 연관성을 뜻함
  • 좌우 노드의 R² 값은 해당 열과 중앙 대사체 노드 사이의 결정계수임
  • 연결선 두께는 marginal R²를 나타내며, 선은 R² > 0.3이면 불투명하고 0.3 > R² > 0.1이면 반투명함
  • Benjamini-Hochberg adjusted p-values < 0.001인 연관만 표시됨

토론과 해석

• 건강한 성인을 대상으로 커피 섭취, 인지, 기분, 행동, 장내 미생물군을 함께 조사했고, 중등도 커피 섭취자와 비섭취자를 비교한 뒤 2주간 금단과 caffeinated·decaffeinated 재도입까지 포함해 카페인 효과와 커피 효과를 구분함
• 정기적 커피 섭취자는 비섭취자보다 충동성과 정서 반응성이 높았고, 금단 동안에는 주의력과 vigilance가 증가하는 한편 충동성과 정서 반응성은 감소함
• caffeinated와 decaffeinated 커피를 다시 마신 뒤에는 지각된 스트레스와 자기보고 우울 증상이 모두 감소했고, 두 집단 모두에서 재도입 뒤 충동성도 감소함
• 불안과 심리적 고통 감소는 caffeinated 커피 재도입에서만 나타났고, 이는 인지와 기분에 대한 카페인 특이 효과와 연결됨 45
• CAR와 SECPT 전·중·후 cortisol 수준은 커피 섭취자와 비섭취자 사이에 유사하게 나타났고, 이 설계로는 커피의 급성 cortisol 효과를 직접 보지 못함
  • 다른 연구에서는 커피가 cortisol 생산을 활성화할 수 있고 13 46, 장기간 섭취는 스트레스에 대한 cortisol 반응을 약화시켜 부분적 내성으로 이어질 수 있음 13 15
• 커피 섭취자는 기저 혈장 CRP가 더 낮고 IL-10은 더 높았으며, LPS 자극 뒤 IL-6 분비도 더 적었음
  • 금단 뒤에는 CRP와 TNFα가 함께 증가함
  • caffeinated 재도입에서는 혈장 IL-10과 IL-6이 모두 감소했고, LPS 유도 IL-6는 caffeinated와 decaffeinated 재도입 모두에서 절반 수준으로 감소함
  • 식이 (poly)phenol 섭취 증가는 더 낮은 CRP와 연결된다는 점도 함께 다뤄짐 49
• 대변 비표적 metabolomics에서는 caffeine과 fumaric acid 같은 커피 연관 화합물이 달라졌고, GABA와 IPA 같은 신경활성 화합물은 커피 섭취자에서 감소함
  • ICA도 변화했으며, 이는 장내 미생물 유래 tryptophan 대사체로서 IL-10과 AHR를 통한 장 항상성과 연결되는 항목으로 함께 다뤄짐 52
• 커피 섭취자는 비섭취자와 다른 gut microbiome 구성을 보였고, alpha-diversity 변화도 확인됨
  • 커피 섭취자에서는 Cryptobacterium curtum, Eggerthella sp., Firmicutes bacterium이 증가함
  • 금단 뒤 Eggerthella sp. CAG:209와 Firmicutes CAG:94는 NCD와 유사한 수준으로 돌아감 Fig. 3
  • 재도입의 영향을 받은 여러 종은 본래 oral cavity 또는 치아 미생물군에 거주하는 종들로 정리됨 56
• 소변 데이터는 카페인 유래 대사체와 (poly)phenol 유래 대사체를 뚜렷하게 구분했고, 대변 프로파일은 주로 (poly)phenol 대사를 반영하며 caffeinated군과 decaffeinated군을 구분하지 못함
• 소변의 측정 phenolics에서는 개인 간 변동성이 매우 높았고, 장내 미생물군이 phenolic catabolism의 개인차에 영향을 줄 수 있다는 해석과 맞물림 29 30 59
• NCD 참가자는 더 낮은 충동성과 정서 반응성, 더 나은 인지 안정성, 더 낮은 염증 위험, 더 안정적인 혈압, 구별되는 장내 미생물군·대사체 프로파일, 카페인 금단 증상 회피의 이점을 보이는 경향이 함께 나타남
• 동시에 caffeinated 커피는 불안, 심리적 고통, 혈압을 낮추고 주의력과 스트레스 대처를 개선했으며, decaffeinated 커피는 수면, 신체 활동, 기억을 향상시킴
  • 두 종류 모두 스트레스, 우울, 충동성, 염증을 낮추고 기분과 인지 수행을 높이는 양상을 보임
• 연구 한계도 함께 다뤄짐
  • 커피가 조절할 수 있는 stool transit time을 직접 측정하지 않았고, 대신 Bristol Stool Scale과 GI-VAS를 대리지표로 사용함 61
  • NCD군의 기저 caffeine 금단 상태가 집단 차이에 영향을 줬을 가능성을 인정함
  • 표본 내 다양한 ethnic group의 대표성이 제한돼 ethnicity별 차이는 분석하지 않았음 Table 1
  • 1차 가설을 넘어서는 결과들에 대해서는 small to medium effect size를 탐지하기에 충분한 검정력이 아닐 수 있음
• 최종적으로 커피는 정서 반응성, 면역 반응, 미생물 구성에 구별되는 효과를 보였고, microbiota-gut-brain axis 조절자로서의 잠재력이 강조됨

방법

• 윤리 승인

  • 연구 프로토콜은 Cork Teaching Hospitals의 Clinical Research Ethic Committee 승인을 받았고, 식별 번호는 APC115임
  • ClinicalTrials.gov에는 NCT05927038과 NCT05927103으로 등록됨
  • 모든 참가자로부터 informed consent를 받음

• 방문 절차와 커피 개입

  • screening visit는 University College Cork에서 진행했고, M.I.N.I version 7.0.2, CTQ, ROME-IV로 정신 건강과 위장관 건강을 평가함 63 64
  • 일상적 카페인 섭취는 7-day caffeine consumption diary, 언어 IQ 평가는 NART로 수행함 65
  • baseline 전 1주 동안 NCD와 CD 모두 다른 종류의 카페인 음료와 dark chocolate를 피했고, CD는 평소 마시던 커피만 예외로 허용됨
  • washout 뒤 CD는 제공된 커피를 하루 4 sachets, 3주간 마시도록 안내받음
  • 제공된 커피는 Nescafé Classic caffeinated or decaffeinated였고, sachet당 1.8 g instant coffee였음
  • 개입 기간에는 다른 커피나 카페인 음료는 허용되지 않았고, hot water, milk, sugar는 참가자가 선택해 함께 섭취함
  • 추가 stool sample은 금단 시작 뒤 day 2, day 4, 개입 시작 뒤 day 16, day 18, day 28에 수집함

• 제외 기준

  • 유의한 급성·만성 질환, 피임약·호르몬 보충제를 제외한 약물 복용, antibiotics·probiotics·prebiotics 사용, vegan 식단, 발효식품 과다 섭취, 고혈압, 임신·수유, 현재 흡연, 영어 비숙련, dyslexia·dyscalculia, 다른 시험 참여 중인 경우 등을 제외함
  • antibiotics, probiotics, prebiotics는 참여 전 최소 4주 washout이 필요함

• 식이 섭취 정량화

  • 7-day food diary를 baseline, pre-intervention, post-intervention 전 세 번 작성함 66
  • Nutritics로 macronutrient 섭취를 정량화함
    • https://www.nutritics.com/en/
  • food intake는 weighted 방식으로 처리함

• (poly)phenol 섭취량 계산

  • 식이일지에서 총 1424개 food item을 추출했고, 이 중 391개 비함유 항목은 제외함
  • raw food는 Phenol-Explorer 3.6 기반 in-house database와 매칭했고, 대응되지 않는 식품은 유사 식품 또는 문헌으로 보완함 67
    • www.phenol-explorer.eu
  • 조리·가공 중 무게 변화는 Bognar’s tables, Phenol Explorer, CREA yield factor로 보정함 68 69 70
  • Microsoft Access로 food composition table과 intake table을 매칭하고 mg/100 g 기준 함량을 곱해 섭취량을 계산함
  • 총 클래스는 flavonoids, phenolic acids, lignans, others로 나눠 분석함

• 카페인 섭취량 정량화

  • 7-day caffeine consumption diary로 지난 7일간 섭취한 모든 카페인 음료를 기록하게 함
  • 음료 종류, cup 수 또는 ml, 브랜드, 조제 방법을 기록했고, 이를 바탕으로 mg caffeine/day를 계산함

• 자기보고 설문과 인지 과제

  • Visits 2, 3, 4에서 PSS, ERS, UPPS-P, HSCL, BDI, STAI, PSQI, IPAQ, GI-VAS를 시행했고, 대변 형태는 Bristol stool chart로 보고함 71~79
  • washout와 intervention 동안 CD는 CWSQ, QCC, VAS-F로 caffeine craving과 피로를 추적함 79 80 81
  • ModRey는 20개 단어 목록 A와 B를 이용한 episodic memory 검사임 82
  • PAL은 CANTAB 기반 시공간 기억 검사로 8개 레벨로 구성되며 visit 2와 visit 4에서만 시행됨
  • ERT는 6가지 기본 감정을 식별하는 CANTAB 정서 처리 과제이며 visit 2와 visit 4에서만 시행됨
  • PASAT는 60개 숫자가 제시되는 2개 trial로 구성되며 visit 2, 3, 4에서 시행됨

• SECPT

  • Socially Evaluated Cold Pressor Test는 0 °C 얼음물에 손을 3분간 담그게 하는 급성 스트레스 과제임 84
  • 참가자는 카메라와 연구자를 마주 보고 앉았고, 비언어적 행동 기록과 얼굴 표정 녹화가 이뤄짐
  • SECPT 전후로 침 샘플 8개를 수집했고, STAI-State, PASA, PANAS, BL-VAS, VAS stress, VAS pain 등을 시행함 85 86 87

• 생물학적 샘플

  • 침은 기상 후 3분 이내, 30분, 45분, 60분에 수집해 CAR 측정에 사용했고, SECPT 동안 추가 8개 샘플을 수집함 46 88
  • 혈액은 각 방문마다 채취했고, 전혈 LPS 자극과 혈장·혈청 분리를 진행함
  • 소변은 하루의 첫 소변을 수집했고, 대변은 하루 중 처음 배출된 신선한 샘플을 수집함

• 샘플 분석

  • 침 코르티솔은 Cortisol ELISA kit로 측정했고, 샘플은 1:3 희석해 중복 측정함
  • 염증 표지자는 MSD MULTI-SPOT 시스템으로 TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IFNγ, CRP를 측정함
  • 분변 DNA는 QIAamp Power Faecal Pro Kit로 추출하고 NovaSeq 6000 S2 flow cell에서 shotgun 시퀀싱함
  • raw sequence 품질 평가는 FastQC, host filtering은 Bowtie2 + Kneaddata, 분류학·기능 프로파일링은 woltka로 수행함 89 90
  • Woltka SOP는 공개돼 있음
    • https://github.com/qiyunzhu/woltka/blob/master/doc/wolsop.sh
  • Gut-Brain Modules와 Gut-Metabolic Modules는 Gomixer의 R 버전으로 계산함 91
  • semi-polar metabolite 분석은 MS-Omics가 수행했고, 장비는 Thermo Scientific Vanquish LC와 Orbitrap Exploris 240 MS 조합을 사용함
  • SCFA는 산성화와 deuterium labelled internal standards를 이용해 GC 기반으로 분석함
  • 소변 표적 대사체는 UHPLC-ESI-QqQ-MS/MS, pyridines는 별도 triple quadrupole 설정, creatinine은 UHPLC-ESI-MS/MS로 분석함
  • 분변 표적 대사체는 52개 화합물을 SRM mode로 측정했고, 총 123개 faecal samples를 1회씩 분석함 Supplementary Data 23
  • 표적 대사체 데이터는 MetaboLights repository의 MTBLS13494로 공개돼 있음 92

• ADORA2A 유전자형 분석

  • 전혈 100 µl에서 DNA를 추출했고, SNP는 rs5751876, rs2298383 두 개를 선정함
  • 분석은 Karolinska University Hospital의 TAMM에서 iPLEX Gold chemistry와 MassARRAY 시스템으로 수행함 93 94 95 96 97
  • 가용 데이터와의 concordance, trio family 검증, 중복 분석 모두에서 100% 일치함

• 바이오인포매틱스와 통계

  • 추가 데이터 처리는 R 4.2.0과 Rstudio GUI 2022.2.2.485에서 수행함
  • species level 기준 샘플의 60% 미만 prevalence taxa는 alpha diversity를 제외한 분석에서 제외함
  • PCA는 clr transformed 값으로 수행했고, zero 값은 const approach로 대체함
  • beta diversity는 Aitchison distance, 평가는 vegan package의 PERMANOVA, alpha diversity는 iNEXT로 계산함
  • differential abundance는 선형모형, longitudinal repeated measures는 linear mixed effect models를 사용함
  • 변수 선택은 Benjamini-Hochberg procedure, 임계값은 q-value 0.2임
  • 주요 평가 지표는 미생물군 조성과 기능이고, 2차 평가 지표에는 장내 미생물 대사산물, SCFA, 커피 관련 대사산물, 인지 수행, 급성 스트레스 반응, 말초 혈액 염증 프로필, CAR이 포함됨
  • 표본 수 계산은 g*Power로 수행했고, 그룹당 최소 필요 표본 수는 18명, 총 필요 수는 36명으로 설정함
  • 최종적으로 118명의 잠재 참가자를 선별한 뒤 92명을 등록해 62명을 최종 모집함
  • 통계 분석은 SPSS version 28과 R version 4.2.0을 사용했고, 이상치는 Grubb’s test로 식별한 뒤 제거함
  • baseline의 NCD 대 CD 비교에는 주로 General Linear Model Univariate를, 그 외 분석에는 Mixed Models와 Bonferroni 사후 비교를 사용함
  • 범주형 데이터는 Pearson 카이제곱 검정, 유의 기준은 p < 0.05임

데이터와 코드 가용성

• 비표적 대사체학 데이터는 MetaboLights의 MTBLS13401에 등록돼 있음
• 표적 대사체학 데이터는 MetaboLights의 MTBLS13494에서 제공됨
• 미생물군 카운트 데이터는 Zenodo의 10.5281/zenodo.18661295, 참가자 메타데이터는 10.5281/zenodo.18348935에 업로드됨
• 원시 미생물군 데이터는 ENA 데이터베이스 접근 코드 PRJEB108545로 제공됨
• 모든 원본 코드는 GitHub에 공개돼 있음
  • https://github.com/thomazbastiaanssen/coffee/